Methode zur Analyse von L-4-Nitrophenylalaninmethylester HCl (H-Phe(4-NO2)-OMe·HCl) (CAS: 17193-40-7)
Beschreibung: Geben Sie etwa 2 g Probe in eine saubere und trockene Petrischale und beobachten Sie das Aussehen der Probe. Melden: Melden Sie die Beobachtung
Identifizierung: Vergleichen Sie die Retentionszeit des Hauptpeaks im Chromatogramm der Testzubereitung mit der Retentionszeit des Hauptpeaks im Chromatogramm der Systemeignungszubereitung, wie sie in chromatographischer Reinheit durch HPLC erhalten wird.
Trocknungsverlust: Trocknen Sie eine mit Glas verschlossene, flache Wägeflasche 30 Minuten lang bei 105 ± 2 °C. Lassen Sie es in einem Exsikkator auf Raumtemperatur abkühlen. Wiegen Sie die Wägeflasche mit Stopfen genau und notieren Sie das Gewicht (W1). Geben Sie etwa 1 bis 2 g genau abgewogene Menge der Testsubstanz in die Wägeflasche. Durch leichtes, seitliches Schütteln den Prüfkörper möglichst gleichmäßig bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm verteilen. Wiegen Sie die beladene Wägeflasche und notieren Sie das Gewicht (W2). Stellen Sie die beladene Flasche in den Trockenofen, entfernen Sie den Stopfen und lassen Sie sie ebenfalls in der Kammer. Trocknen Sie die Testprobe 3 Stunden lang bei 105 ± 2 °C. Schließen Sie die Flasche nach dem Öffnen der Kammer sofort und lassen Sie sie in einem Exsikkator auf Raumtemperatur kommen. Wiegen Sie die Wägeflasche mit Stopfen genau ab und ermitteln Sie das Gewicht (W3). Berechnen Sie den prozentualen Verlust beim Trocknen der Probe mithilfe der folgenden Formel:
Berechnung Verlust beim Trocknen (% w/w) = (W2-W3) ÷ (W2-W1) x 100
Enantiomerengehalt laut HPLC:
Chemikalien und Reagenzien:
n-Hexan AR-Qualität
Methanol-HPLC-Qualität
Isopropylalkohol HPLC-Qualität
Diethylamin AR-Qualität
Standards: L-4-Nitrophenylalaninmethylester-HCl-Standard; L-4-Nitrophenylalaninmethylester-HCl-Enantiomerstandard
Mobile Phase: Bereiten Sie eine homogene Mischung aus n-Hexan, Isopropylalkohol, Methanol und Diethylamin vor (65:20:15:0,1 v/v/v/v).
Blindwertvorbereitung: 2,5 ml Methanol in einen 10-ml-Messkolben überführen, mit der mobilen Phase auf das Volumen verdünnen und mischen.
Vorbereitung der Systemeignung:
Wiegen Sie genau ab und geben Sie jeweils etwa 5 mg L-4-Nitrophenylalanine Methyl Ester HCl-Standard und L-4-Nitrophenylalanine Methyl Ester HCl-Enantiomer-Standard in einen 10 ml-Messkolben, lösen Sie ihn in etwa 2,5 ml Methanol auf, verdünnen Sie mit der mobilen Phase auf das Volumen und mischen Sie.
Prüfungsvorbereitung:
Genau abwiegen und etwa 5 mg der Probe in einen 10-Mol-Messkolben überführen, in etwa 2,5 ml Methanol auflösen, mit der mobilen Phase auf das Volumen verdünnen und mischen.
Instrumentelle Parameter:
Instrument: HPLC ausgestattet mit Injektor, Pumpe, UV-Detektor und Rekorder
Säule: ChiralPak-IC (4,6 mm x 250 mm) 5 μ oder gleichwertig
Flussrate: 1,0 ml/Minute
Wellenlänge: 260 nm
Injektionsvolumen: 10 μL
Kolonnentemperatur: 25℃
Laufzeit: 20 Minuten
Vorgehensweise
Injizieren Sie die Lösungen wie in der folgenden Reihenfolge beschrieben. Zeichnen Sie die Chromatogramme auf und bestätigen Sie die Kriterien:
Beschreibung der Kriterien für die Anzahl der Injektionen
Blindwertvorbereitung 1 Bei der Retentionszeit von L-4-Nitrophenylalaninmethylester HCl oder Enantiomer sollte kein störender Peak beobachtet werden.
Vorbereitung der Systemeignung 1 Die Auflösung zwischen L-4-Nitrophenylalaninmethylester HCl und dem Enantiomerenpeak sollte nicht weniger als 2,0 betragen
Testvorbereitung 1 Verwenden Sie das Testchromatogramm, um den Enantiomerengehalt in der Probe zu bestimmen.
Relative Aufbewahrungszeiten:
L-4-Nitrophenylalaninmethylester HCl 1,0
Enantiomer Über 1.11
Die Retentionszeit von L-4-Nitrophenylalaninmethylester HCl beträgt etwa 9,8 Minuten.
Berechnung: Im aus der Testvorbereitung erhaltenen Chromatogramm ignorieren Sie alle Peaks außer L-4-Nitrophenylalaninmethylester HCl und Enantiomer. Geben Sie den Enantiomerengehalt in der Probe anhand der Flächennormalisierungsmethode an.
Chromatographische Reinheit und Verunreinigungen durch HPLC:
Chemikalien und Reagenzien:
Diammoniumphosphat AR-Qualität
Phosphorsäure AR-Qualität
Methanol-HPLC-Qualität
Gereinigtes Wasser
Standards
L-4-Nitrophenylalaninmethylester-HCl-Standard
4-Nitro-L-Phenylalanin-Monohydrat-Standard
Mobile Phase-A
Lösen Sie 6,6 g Diammoniumphosphat in 1000 ml gereinigtem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert dieser Lösung mit Phosphorsäure auf 6,0 ein. Filtern und entgasen. Bevor Sie den pH-Wert der Lösung messen, kalibrieren Sie das pH-Messgerät mit einer Standardpufferlösung pH 4,01 UND 7,00.
Mobile Phase-B
Methanol-HPLC-Qualität
Vorbereitung der Systemeignung
Wiegen Sie genau ab und geben Sie jeweils etwa 25 mg L-4-Nitrophenylalaninmethylester-HCl-Standard und 4-Nitro-L-Phenylalanin-Monohydrat-Standard in einen 50-ml-Messkolben, lösen Sie ihn in Methanol auf, verdünnen Sie ihn auf das Volumen und mischen Sie.
Testvorbereitung:
Genau abwiegen und etwa 25 mg Probe in einen 50-ml-Messkolben überführen, in Methanol auflösen, auf das Volumen auffüllen und mischen.
Instrumentelle Parameter:
Instrument: HPLC ausgestattet mit Injektor, Pumpe, UV-Detektor und Rekorder
Säule: XTerra RP-18 (4,6 mm x 150 mm) 5 μ oder gleichwertig
Flussrate: 1,0 ml/Minute
Wellenlänge: 265 nm
Injektionsvolumen: 20 μL
Kolonnentemperatur: 25℃
Laufzeit: 45 Minuten
Gradientenprogramm
Zeit (Min.) Mobile Phase-A % Mobile Phase-B %
0,01 90 10
15 60 40
35 40 60
40 35 65
41 90 10
45 90 10
Vorgehensweise:
Injizieren Sie die Lösungen wie in der folgenden Reihenfolge beschrieben. Zeichnen Sie die Chromatogramme auf und bestätigen Sie die Kriterien:
Blindwertvorbereitung 1 Bei der Retentionszeit von L-4-Nitrophenylalaninmethylester HCl sollte kein störender Peak beobachtet werden.
Vorbereitung der Systemeignung 1 Der Tailing-Faktor für den L-4-Nitrophenylalanine Methyl Ester HCl-Peak sollte nicht weniger als 2,0 betragen
Testvorbereitung 1 Verwenden Sie das Testchromatogramm, um die chromatographische Reinheit und Verunreinigungen zu bestimmen.
Relative Aufbewahrungszeiten:
L-4-Nitrophenylalaninmethylester HCl 1,0 (Retentionszeit ca. 11,4 Minuten)
4-Nitro-L-Phenylalanin Ungefähr 0,4
Toluol ca. 2,3
Berechnungen:
Im bei der Testvorbereitung erhaltenen Chromatogramm darf nach der Blindwertkorrektur der durch Toluol verursachte Peak außer Acht gelassen werden. Geben Sie die chromatographische Reinheit, den 4-Nitro-L-Phenylalanin-Gehalt und die Gesamtverunreinigungen in der Probe anhand der Flächennormalisierungsmethode an.